非达霉素具有以下作用：是一种大环内酯类抗生素，口服后通过在异丁酰酯处水解，将非达索霉素转化为其主要的和具有药理活性的代谢物OP-1118，通过在转录周期起始阶段抑制细菌RNA聚合酶来介导对艰难梭菌的杀菌活性。除艰难梭菌外，非达霉素对革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌和肠球菌属)具有中等抑制作用，对正常结肠菌群(包括厌氧菌和肠道革兰氏阴性杆菌)的活性较弱。主要在粪便中排泄，目前未有非达霉素可以抑制Notch信号通路，具有抗肿瘤作用的报道。
如上所示，本发明提供了非达霉素的新用途，通过抑制Notch信号通路来达到抗肿瘤的作用。
发明内容
本发明提供了一种药物非达霉素，该药物是FDA批准上市药物，能够用于制备具有抑制Notch通路与抗肿瘤作用的药物。
本发明提供的非达霉素，非达霉素能够用于制备Notch通路抑制剂，通过抑制Notch通路导致其抗肿瘤作用；抑制Notch信号通路包括但不限于抑制Notch通路关键转录因子RBP-jk，改变Notch协同因子或效应因子的表达或功能。
非达霉素对急性T淋巴细胞性白血病细胞T-ALL、Luminal型人乳腺癌细胞系MCF-7、三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231和小鼠乳腺癌细胞系4T1均具有一定的抑制作用。其对Jurkat细胞的IC
本发明证实，可以使用Notch通路抑制剂非达霉素治疗的肿瘤，其发病往往与Notch通路异常激活有关，因此可以使用Notch抑制剂，如DAPT、siRNA、microRNA以及抗体等治疗可以使用非达霉素治疗的肿瘤，或联合使用非达霉素和其他Notch通路抑制剂治疗可以使用非达霉素治疗的肿瘤。
附图说明
图1为非达霉素对人乳腺癌细胞系MCF-7的细胞毒性结果图。其中，非达霉素药物的给药浓度梯度为5μM、25μM、50μM、75μM、100μM，IC
图2为非达霉素对鼠源乳腺癌细胞系4T1的细胞毒性结果图。其中，非达霉素药物的给药浓度梯度为25μM、30μM、35μM、40μM、50μM，IC
图3为非达霉素对人乳腺癌细胞系MDA-MB-231的细胞毒性结果图。其中，非达霉素药物的给药浓度梯度为5μM、50μM、100μM、200μM、400μM，IC
图4为非达霉素对T细胞Jurkat的细胞毒性结果图。其中，非达霉素药物的给药浓度梯度为5μM、50μM、100μM、200μM、400μM，IC
图5为qRT-PCR检测Notch通路相关分子Notch1、HES1、HES5、HEY1在非达霉素(Fidaxomicin)药物分别作用24h、48h后的基因表达变化情况(mean±SD，n＝3,*p
图6为Western blot检测Notch通路下游分子HES1、HES5在非达霉素药物作用24h(A)与48h(B)后的蛋白表达变化情况。GAPDH为内参蛋白，C24表示使用完全培养基孵育细胞24h，M24表示非达霉素药物孵育4T1细胞24h，C48表示使用完全培养基孵育细胞48h，M48表示非达霉素药物孵育4T1细胞48h(mean±SD，n＝3,***p
图7为非达霉素对4T1-荷瘤小鼠的肿瘤抑制效果图。Control组为瘤内注射生理盐水对照，F-1、F-2、F-3分别表示非达霉素高、中、低剂量组(mean±SD,n＝5,**p＜0.01,****p＜0.0001,与Control组相比)。
图8为非达霉素对4T1-荷瘤小鼠体重影响图。
图9为Western blot检测Notch通路下游分子HES1(A)与HES5(B)在非达霉素药物不同剂量(50mg/kg、25mg/kg、5mg/kg)后肿瘤组织中蛋白表达变化情况。Control组为瘤内注射生理盐水对照，F-1、F-2、F-3分别表示非达霉素高、中、低剂量组(mean±SD,n＝3,*p＜0.05,**p＜0.01,***p＜0.001,****p
具体实施方式
以下结合附图通过具体的实施例对本发明作进一步描述，这些实施例仅用于说明本发明，并不是对本发明保护范围的限制。
实施例
实施例1非达霉素抑制T细胞Jurkat、Luminal型人乳腺癌细胞系MCF-7、三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231及鼠源乳腺癌细胞系4T1的体外增殖实验
细胞种板：T-ALL、MCF-7、MDA-MB-231和4T1细胞(均购自中科院上海细胞库)用完全培养基(MCF-7：含有体积分数10％的胎牛血清和体积分数为1％的青霉素-链霉素双抗的DMEM培养基；4T1、Jurkat、MDA-MB-231：含有体积分数为15％的胎牛血清和体积分数为1％的青霉素-链霉素双抗的RPMI1640培养基)接种于25T培养瓶，在37℃，5％CO2条件下培养48小时后，显微镜观察细胞生长状态，待细胞生长密度达到80％-90％后，即可进行传代。吸去25T培养瓶内原有培养基，取胰酶清洗两遍，弃去胰酶-培养基混合液后加入1mL胰酶，转移至培养箱中消化3-5min，显微镜下观察细胞变的圆润透明后加入2mL完全培养基终止消化，使用无菌吸管吹打瓶壁上细胞形成细胞悬液，1000rpm离心5min后弃去上清液，加入完全培养基吹打重悬细胞，使用排枪按照每孔100μL将细胞悬液均匀的种到96孔板中，在37℃，5％CO
细胞给药：按照预实验结果确定药物的浓度梯度(MCF-7：5μM、25μM、50μM、75μM、100μM；4T1：25μM、30μM、35μM、40μM、50μM；MDA-MB-231：5μM、50μM、100μM、200μM、400μM；Jurkat：5μM、50μM、100μM、200μM、400μM)将药物溶解到含有体积分数为0.1％的DMSO的培养基中，取96孔板去除原有培养基，加入不同浓度药物，每孔100μL，每个药物浓度设置5个复孔，余下孔加入100μL培养基作为空白对照，转移到细胞培养箱中培养48h。
细胞增殖活性检测：非达霉素孵育48h后，吸出孔内原有培养基，每孔加入100μL体积分数为5％的CCK-8试剂，转移至细胞培养箱中孵育1-2h。然后使用酶标仪在450nm处检测各孔的OD值。计算非达霉素对Jurkat、MCF-7、MDA-MB-231、4T1细胞的IC
计算结果显示，非达霉素对MCF-7、4T1、MDA-MB-231、Jurkat细胞的IC
实施例2非达霉素体外抑制Notch通路的验证实验
按照实施例1细胞种板操作步骤将4T1细胞接种于4块6孔板中，每组设置3个复孔，实验组每孔加入非达霉素(32.3μM)2mL，对照组每孔加入2mL RPMI1640培养基，分别置于培养箱中孵育24h、48h。具体实验分组如下表所示：
表1实验分组
qRT-PCR(检测RNA表达)：
(1)RNA提取
分别处理不同时间点样本。首先，将六孔板中培养基吸出，使用2mL PBS清洗一次，加入500μL的Lysis Buffer，用力吹吸10次，转移至1.5mL离心管中涡旋10秒钟以充分裂解细胞，然后加入500μL无水乙醇充分混匀。混匀后将液体加入离心柱中12000g离心1min。向柱中加入500μL Wash Buffer，12000g离心1min，倒掉废液，将RNA柱装回收集管，空管离心一次除去残留的Wash Buffer。然后将柱子放到干净的无RNA酶的1.5mL离心管上。在RNA柱的膜中心位置加入20-30μL的Elution Buffer，室温静置2min后12000g离心1min，将洗脱下来的RNA溶液重新加入柱中，静置5min，使离心柱中残留的RNA充分溶解在Elution Buffer中，再次12000g离心1min，得到RNA溶液。
使用Nanodrop软件测定提取总RNA浓度与纯度。
(2)逆转录
根据测得的总RNA浓度计算1μg总RNA体积。取1μg总RNA加入八联管中，加入2μLDNA酶，加入Rnase水至16μL，用移液枪轻轻吹打10次，室温条件下放置5min，去除体系中含有的DNA。加入4μg的5×RT Mix，用移液枪吹打10次，充分混匀。在42℃条件下反应15分钟，稀释10倍后作为模板进行qPCR。
(3)qPCR
使用八联管按照表2配制qPCR反应体系。配制完成后用移液枪吹打反应体系，然后使用离心机将八联管中反应体系离心以达到充分离心的目的。
表2 qPCR反应体系
配置好反应体系，将八联管按照标定顺序依次放入LightCycler96实时荧光定量PCR仪的96孔板中。按照表3设置反应程序。
表3 qPCR反应程序
GAPDH作为内参，采用相对定量法进行分析。结果表明与对照组样本相比，分别给药24h、48h后，可以检测到基因Notch1、HES1、HES5、HEY1的表达显著下调(图3)。
Western blot(检测蛋白表达)：
(1)细胞样本蛋白提取
使用2mL胰酶消化细胞转移至15mL离心管，500g离心5min后弃掉上清，向离心管中加入10mL预冷PBS，1000rpm离心10min，重复洗两次。加入1.5mL裂解液，超声破碎细胞，每次30sec，间隔1min，超声4次，14000rpm，4℃离心15min，取上清液即为全蛋白提取液。
(2)蛋白浓度测定
a.根据样本数量计算所需工作液总体积，使用改良型BCA蛋白浓度测定试剂盒。根据试剂盒说明书按照1×溶液A：溶液B体积比50：1的比例配制BCA工作液。
b.将改良型BCA蛋白浓度测定试剂盒中溶液D与蒸馏水按照体积比1：1比例稀释，混匀制得溶液E
d.取8支1.5mL离心管，按照试剂盒要求配制牛血清白蛋白(BSA)浓度为0、25、75、125、250、500、750、1000μg/mL的80μL体系，用于制作标准曲线。
e.采用酶标板法，取酶标板，分为标准组与样品组，每组设置1个复孔，其中16孔加入5μL相应浓度的标准蛋白质溶液，余下孔分别加入不同的5μL样品稀释液。然后，分别向每孔中加入5μL改良型BCA蛋白浓度测定试剂盒中溶液F，用移液枪迅速混匀，37℃水浴保温30min。
f.向每孔中分别加入200μL BCA工作液，用移液枪迅速混匀，37℃水浴保温30min。
g.待酶标板冷却至室温后，使用酶标仪在562nm条件下测定各孔的吸光度值。
h.根据结果绘制标准曲线，根据标准曲线函数计算样品的蛋白质浓度。
(3)聚丙烯酰胺凝胶电泳
a.取各实验组全蛋白提取液涡旋混匀，而后离心。根据标准曲线计算样品的蛋白浓度后，使用蛋白上样缓冲液、PBS稀释样品，使样品终浓度为2mg/mL。将稀释后的样品在100℃金属浴中煮10min，置于冰上待用。
b.分离胶的配制：由于目标蛋白的分子量都小于40kD，所以采用质量分数为15％的分离胶。使用上海生工SDS-PAGE变性丙烯酰胺凝胶快速制备试剂盒配制20mL质量分数为15％的分离胶。取50mL烧杯，分别加入4.8mL双蒸水、10mL质量分数为30％的Acr-Bis(acrylamide与bisacrylamide的质量比为29：1)、5mL Gel buffer A、0.2mL质量分数为10％的APS、0.012mL TEMED混匀。
c.用1mL移液枪吸取配制好的分离胶加入玻璃胶板中，然后缓慢加入双蒸水进行封闭去除分离胶中的气泡。
d.约30min后分离胶凝固。待分离胶凝固后，使用上海生工SDS-PAGE变性丙烯酰胺凝胶快速制备试剂盒配制6mL浓缩胶。取50mL烧杯，分别加入2mL双蒸水、1mL质量分数为30％的Acr-Bis(acrylamide与bisacrylamide的质量比为29：1)、3mL Gel buffer A、0.06mL质量分数为10％的APS、0.006mL TEMED混匀。将玻璃胶板上层双蒸水倒掉，用滤纸沿一侧将残留水分吸干，加入配置好的浓缩胶，并迅速插上梳子。
e.待浓缩胶凝固后。配制电泳液。使用上海生工的10×蛋白电泳缓冲液。电泳前，用去离子水稀释至1×蛋白电泳缓冲液。将胶板及电泳架放置到电泳槽内，加入适量电泳液，拔掉梳子。
f.样品震荡涡旋上样。Marker上样3μL，样品上样10μL，上样完毕后，将两块胶板之间的电泳液加满，随后按照正负极对应盖上盖子进行电泳。
g.首先，在80V条件下，运行30min，待Marker条带分离开后将电压调节至110V，运行70min。
(4)转膜
a.使用上海生工的10×转膜液。根据所需转膜缓冲液的体积，按照10×转膜液：去离子水：甲醇体积比为1：7：2的比例预先配制转膜液，置于4℃待用。
b.PVDF膜做好标记(样品名称)，置于甲醇中激活。
c.倒掉电泳液，取出胶板，将凝胶切边，置于转膜缓冲液中，按照夹心法依次将海绵、滤纸、凝胶、PVDF膜、滤纸、海绵按照顺序放置好，小心去除凝胶和PVDF膜上的气泡。然后，按照PVDF膜位于阳极侧，凝胶位于阴极测的规则将夹板插入转膜架中，加入转膜缓冲液，接通电源，电泳槽周围加入冰袋低温300V 60min条件运行。
(5)封闭
用镊子将PVDF膜从夹板中取出，放入质量分数为5％的脱脂奶粉封闭液中(转膜侧朝上)，置于摇床上缓慢摇动，室温封闭1h。
(6)一抗孵育
a.封闭完成后，弃去奶粉封闭液，加入适量TBST清洗PVDF膜，置于摇床上快速摇动，清洗3次，每次15min。
b.将HES1、HES5、GAPDH抗体按照说明书建议稀释比例稀释，然后将PVDF膜转移至对应抗体溶液中，4℃孵育过夜。
(7)孵育二抗
a.一抗封闭后，加入适量TBST清洗PVDF膜，置于摇床上快速摇动，清洗3次，每次15min。
b.将二抗按照体积比1：8000比例稀释，然后将PVDF膜转移至对应抗体溶液中，室温摇床上孵育2h。
(8)化学发光显影
a.二抗封闭后，将PVDF膜浸润至TBST缓冲液中，置于摇床上洗涤5次，每次15min。
b.取出ECL发光试剂盒，等量混合ECL发光试剂盒中Ⅰ液和Ⅱ液(皮克级)，用平头镊子钳住PVDF膜，垂直置于吸水纸上吸取膜上TBST缓冲液，然后将膜置于混合液中反应，反应完成后，将PVDF膜吸附蛋白面朝上，置于X光片板上曝光。
扫描条带灰度值，以GADH作为内参，对各组的目的蛋白表达量进行分析。结果表明，在药物作用24h后，HES1、HES5蛋白均未出现明显的表达下调，在药物作用48h后，HES1、HES5蛋白表达量相较于对照组显著下调。与细胞在药物孵育24h后无明显凋亡，48h后明显凋亡相互印证。这说明非达霉素通过Notch通路，从而抑制肿瘤细胞增殖。
实施例3非达霉素对4T1-荷瘤小鼠的体内抑制肿瘤作用
通过建立4T1-荷瘤小鼠模型来考察非达霉素的体内抗肿瘤与Notch通路抑制作用，其方法与结果如下：
材料与分组：6-8周(体重20-22g)的雌性balb/c小鼠30只，实验分组为非达霉素高剂量组(F-1,50mg/kg)、非达霉素中剂量组(F-2,25mg/kg)、非达霉素低剂量组(F-3,5mg/kg)、阳性对照DAPT组(25mg/kg)、化药5-FU(25mg/kg)组、生理盐水组。
4T1-荷瘤小鼠模型构建：收集培养细胞悬浮于PBS中制备成1×10
给药：待肿瘤生长到体积大概100mm
肿瘤解剖：给药结束第二天使用二氧化碳窒息法处死小鼠，然后使用手术器械将给药组和模型组的小鼠解剖，完整剥离出肿瘤瘤组织。结果表明非达霉素中、高剂量组肿瘤体积与生理盐水组相比有显著差异(p
实施例4非达霉素体内抑制Notch信号通路
Western blot检测肿瘤组织中HES1、HES5的蛋白表达：
首先进行肿瘤组织中全蛋白提取，称取100mg肿瘤组织，手术剪剪碎肿瘤组织，尽量去除脂肪组织及结缔组织等非目的组织，用预冷PBS洗涤两次，离心取沉淀后加入1mL的预冷Lysis Buffer，使用电动组织匀浆器将肿瘤组织匀浆，置于冰上裂解10min，15000g，4℃条件下离心10min，取上清转移至新的预冷的离心管中，即为全蛋白提取物
然后根据实施例2中操作步骤分别进行电泳、转膜、封闭、一抗孵育、二抗孵育、化学发光显影与条带灰度值扫描。以GADH作为内参，对各组的目的蛋白表达量进行分析。结果表明，非达霉素高、中、低剂量组均显著下调Notch通路下游蛋白HES1、HES5的表达。
