非达霉素(Fidaxomicin/Dificid)是2011年获得FDA批准上市的一种用于治疗艰难梭菌(Clostridium difficile)感染的新型窄谱大环内酯类抗生素。与治疗艰难梭菌感染的同类抗生素相比,非达霉素在治疗中安全性更好,复发率更低,因此具有广阔的应用前景。非达霉素起初主要是由放线菌类指孢囊菌(Dactylosporangium aurantiacum)NRRL18085或游动放线菌(Actinoplanes deccanensis)ATCC 21983发酵产生。提高非达霉素产量以达到工业化生产需求是国内研究的热点。本论文以德干高原游动放线菌为研究对象,利用氮离子诱变、核糖体工程和Tn5转座子插入技术为实验手段,以提高非达霉素的产量为目的,开展菌株选育和发酵工艺优化,同时对突变株的高产机理进行初步的探讨。根据形态特征观察,并结合16S rDNA系统发育树分析对菌株SIIA-A2098进行分类鉴定。结果显示,菌株SIIA-A2098的形态特征和培养特征与A.deccanensis基本一致。菌株SIIA-A2098的16S rDNA序列与A.deccanensis IFO13994的相似度达到100%,系统发育树显示菌株SIIA-A2098与A.deccanensis IFO13994亲缘关系最近。因此,确定菌株SIIA-A2098为德干高原游动放线菌。通过氮离子诱变技术对菌株SIIA-A2098进行诱变选育得到非达霉素产量提高近8倍的突变株SIIA-M3510。然后,采用了核糖体工程技术对菌株SIIA-M3510进行诱变,得到具有链霉素抗性的突变株SIIA-10L-2,非达霉素产量提高了5.4倍,达到502μg/mL,且传代考察结果表明菌株SIIA-10L-2的发酵性能稳定。另外,本文采用了Tn5转座子插入技术对菌株SIIA-M3510进行选育。结果显示,Tn5转座子插入突变株非达霉素产量波动较大,但未得到非达霉素产量显著提高的突变株。对链霉素抗性突变株SIIA-10L-2的发酵条件和发酵培养基进行优化,使菌株SIIA-10L-2的非达霉素产量较优化前提高了66%,达到760μg/mL。对菌株SIIA-10L-2突变前后的rpsL和rsmG两段基因序列进行克隆测序后发现,rpsL基因序列上第114位的T突变成为C,即所编码的氨基酸由亮氨酸(CTT)变为脯氨酸(CCT)。综上,本论文利用氮离子注入诱变和核糖体工程选育得到链霉素抗性高产突变株,并对其高产机理进行了探讨。另外,本论文成功将Tn5转座子质粒插入到游动放线菌基因组DNA上,并成功表达。因此,核糖体工程和Tn5转座子插入技术可以激活游动放线菌潜在的基因资源,能够为工程菌株的选育提供更多理论基础。展开
