非达霉素具有以下作用：是一种大环内酯类抗生素，口服后通过在异丁酰酯处水解，将非达索霉素转化为其主要的和具有药理活性的代谢物op-1118，通过在转录周期起始阶段抑制细菌rna聚合酶来介导对艰难梭菌的杀菌活性。除艰难梭菌外，非达霉素对革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌和肠球菌属)具有中等抑制作用，对正常结肠菌群(包括厌氧菌和肠道革兰氏阴性杆菌)的活性较弱。主要在粪便中排泄，目前未有非达霉素可以抑制notch信号通路，具有抗肿瘤作用的报道。
如上所示，本发明提供了非达霉素的新用途，通过抑制notch信号通路来达到抗肿瘤的作用。
技术实现要素：
本发明提供了一种药物非达霉素，该药物是fda批准上市药物，能够用于制备具有抑制notch通路与抗肿瘤作用的药物。
本发明提供的非达霉素，非达霉素能够用于制备notch通路抑制剂，通过抑制notch通路导致其抗肿瘤作用；抑制notch信号通路包括但不限于抑制notch通路关键转录因子rbp-jk，改变notch协同因子或效应因子的表达或功能。
非达霉素对急性t淋巴细胞性白血病细胞t-all、luminal型人乳腺癌细胞系mcf-7、三阴性乳腺癌细胞系mda-mb-231和小鼠乳腺癌细胞系4t1均具有一定的抑制作用。其对jurkat细胞的ic50值为32.2μm，对mcf-7、mda-mb-231细胞的ic50值分别为53.4μm、28.6μm，对4t1细胞的ic50值为32.3μm，且具有剂量依赖性。在药物孵育细胞24h、48h后，notch通路相关基因notch1、hes1、hes5、hey1的表达均出现显著性下调。非达霉素作用24h后，hes1、hes5的蛋白表达量未见明显下调，作用48h后，hes1、hes5的蛋白表达量均出现显著下调。同时，非达霉素作用24h后未见细胞大量凋亡，48h后细胞大量凋亡。并且该药物也具有体内抗肿瘤效果，非达霉素给药剂量分别为50mg/kg、25mg/kg时，4t1-荷瘤小鼠的肿瘤体积均显著小于空白对照组。并且，非达霉素的体内抗肿瘤活性具有剂量依赖性并且对小鼠体重影响小，安全性高。本发明的工作表明非达霉素具有显著的体内抗肿瘤活性和较高的体内安全性。此外，非达霉素显著下调notch通路下游蛋白hes1、hes5的表达，并且随着药物浓度的增高，hes1、hes5蛋白的表达越低。
本发明证实，可以使用notch通路抑制剂非达霉素治疗的肿瘤，其发病往往与notch通路异常激活有关，因此可以使用notch抑制剂，如dapt、sirna、microrna以及抗体等治疗可以使用非达霉素治疗的肿瘤，或联合使用非达霉素和其他notch通路抑制剂治疗可以使用非达霉素治疗的肿瘤。
具体实施方式
以下结合附图通过具体的实施例对本发明作进一步描述，这些实施例仅用于说明本发明，并不是对本发明保护范围的限制。
实施例
实施例1非达霉素抑制t细胞jurkat、luminal型人乳腺癌细胞系mcf-7、三阴性乳腺癌细胞系mda-mb-231及鼠源乳腺癌细胞系4t1的体外增殖实验
细胞种板：t-all、mcf-7、mda-mb-231和4t1细胞(均购自中科院上海细胞库)用完全培养基(mcf-7：含有体积分数10％的胎牛血清和体积分数为1％的青霉素-链霉素双抗的dmem培养基；4t1、jurkat、mda-mb-231：含有体积分数为15％的胎牛血清和体积分数为1％的青霉素-链霉素双抗的rpmi1640培养基)接种于25t培养瓶，在37℃，5％co2条件下培养48小时后，显微镜观察细胞生长状态，待细胞生长密度达到80％-90％后，即可进行传代。吸去25t培养瓶内原有培养基，取胰酶清洗两遍，弃去胰酶-培养基混合液后加入1ml胰酶，转移至培养箱中消化3-5min，显微镜下观察细胞变的圆润透明后加入2ml完全培养基终止消化，使用无菌吸管吹打瓶壁上细胞形成细胞悬液，1000rpm离心5min后弃去上清液，加入完全培养基吹打重悬细胞，使用排枪按照每孔100μl将细胞悬液均匀的种到96孔板中，在37℃，5％co2条件下培养24h。
细胞给药：按照预实验结果确定药物的浓度梯度(mcf-7：5μm、25μm、50μm、75μm、100μm；4t1：25μm、30μm、35μm、40μm、50μm；mda-mb-231：5μm、50μm、100μm、200μm、400μm；jurkat：5μm、50μm、100μm、200μm、400μm)将药物溶解到含有体积分数为0.1％的dmso的培养基中，取96孔板去除原有培养基，加入不同浓度药物，每孔100μl，每个药物浓度设置5个复孔，余下孔加入100μl培养基作为空白对照，转移到细胞培养箱中培养48h。
细胞增殖活性检测：非达霉素孵育48h后，吸出孔内原有培养基，每孔加入100μl体积分数为5％的cck-8试剂，转移至细胞培养箱中孵育1-2h。然后使用酶标仪在450nm处检测各孔的od值。计算非达霉素对jurkat、mcf-7、mda-mb-231、4t1细胞的ic50值。
计算结果显示，非达霉素对mcf-7、4t1、mda-mb-231、jurkat细胞的ic50值分别为53.4μm、28.6μm、32.2μm、32.3μm(图1，图2，图3，图4)，均具有一定的抗肿瘤活性。
实施例2非达霉素体外抑制notch通路的验证实验
按照实施例1细胞种板操作步骤将4t1细胞接种于4块6孔板中，每组设置3个复孔，实验组每孔加入非达霉素(32.3μm)2ml，对照组每孔加入2mlrpmi1640培养基，分别置于培养箱中孵育24h、48h。具体实验分组如下表所示：
表1实验分组
qrt-pcr(检测rna表达)：
(1)rna提取
分别处理不同时间点样本。首先，将六孔板中培养基吸出，使用2mlpbs清洗一次，加入500μl的lysisbuffer，用力吹吸10次，转移至1.5ml离心管中涡旋10秒钟以充分裂解细胞，然后加入500μl无水乙醇充分混匀。混匀后将液体加入离心柱中12000g离心1min。向柱中加入500μlwashbuffer，12000g离心1min，倒掉废液，将rna柱装回收集管，空管离心一次除去残留的washbuffer。然后将柱子放到干净的无rna酶的1.5ml离心管上。在rna柱的膜中心位置加入20-30μl的elutionbuffer，室温静置2min后12000g离心1min，将洗脱下来的rna溶液重新加入柱中，静置5min，使离心柱中残留的rna充分溶解在elutionbuffer中，再次12000g离心1min，得到rna溶液。
使用nanodrop软件测定提取总rna浓度与纯度。
(2)逆转录
根据测得的总rna浓度计算1μg总rna体积。取1μg总rna加入八联管中，加入2μldna酶，加入rnase水至16μl，用移液枪轻轻吹打10次，室温条件下放置5min，去除体系中含有的dna。加入4μg的5×rtmix，用移液枪吹打10次，充分混匀。在42℃条件下反应15分钟，稀释10倍后作为模板进行qpcr。
(3)qpcr
使用八联管按照表2配制qpcr反应体系。配制完成后用移液枪吹打反应体系，然后使用离心机将八联管中反应体系离心以达到充分离心的目的。
表2qpcr反应体系
配置好反应体系，将八联管按照标定顺序依次放入lightcycler96实时荧光定量pcr仪的96孔板中。按照表3设置反应程序。
表3qpcr反应程序
gapdh作为内参，采用相对定量法进行分析。结果表明与对照组样本相比，分别给药24h、48h后，可以检测到基因notch1、hes1、hes5、hey1的表达显著下调(图3)。
westernblot(检测蛋白表达)：
(1)细胞样本蛋白提取
使用2ml胰酶消化细胞转移至15ml离心管，500g离心5min后弃掉上清，向离心管中加入10ml预冷pbs，1000rpm离心10min，重复洗两次。加入1.5ml裂解液，超声破碎细胞，每次30sec，间隔1min，超声4次，14000rpm，4℃离心15min，取上清液即为全蛋白提取液。
(2)蛋白浓度测定
a.根据样本数量计算所需工作液总体积，使用改良型bca蛋白浓度测定试剂盒。根据试剂盒说明书按照1×溶液a：溶液b体积比50：1的比例配制bca工作液。
b.将改良型bca蛋白浓度测定试剂盒中溶液d与蒸馏水按照体积比1：1比例稀释，混匀制得溶液e
d.取8支1.5ml离心管，按照试剂盒要求配制牛血清白蛋白(bsa)浓度为0、25、75、125、250、500、750、1000μg/ml的80μl体系，用于制作标准曲线。
e.采用酶标板法，取酶标板，分为标准组与样品组，每组设置1个复孔，其中16孔加入5μl相应浓度的标准蛋白质溶液，余下孔分别加入不同的5μl样品稀释液。然后，分别向每孔中加入5μl改良型bca蛋白浓度测定试剂盒中溶液f，用移液枪迅速混匀，37℃水浴保温30min。
f.向每孔中分别加入200μlbca工作液，用移液枪迅速混匀，37℃水浴保温30min。
g.待酶标板冷却至室温后，使用酶标仪在562nm条件下测定各孔的吸光度值。
h.根据结果绘制标准曲线，根据标准曲线函数计算样品的蛋白质浓度。
(3)聚丙烯酰胺凝胶电泳
a.取各实验组全蛋白提取液涡旋混匀，而后离心。根据标准曲线计算样品的蛋白浓度后，使用蛋白上样缓冲液、pbs稀释样品，使样品终浓度为2mg/ml。将稀释后的样品在100℃金属浴中煮10min，置于冰上待用。
b.分离胶的配制：由于目标蛋白的分子量都小于40kd，所以采用质量分数为15％的分离胶。使用上海生工sds-page变性丙烯酰胺凝胶快速制备试剂盒配制20ml质量分数为15％的分离胶。取50ml烧杯，分别加入4.8ml双蒸水、10ml质量分数为30％的acr-bis(acrylamide与bisacrylamide的质量比为29：1)、5mlgelbuffera、0.2ml质量分数为10％的aps、0.012mltemed混匀。
c.用1ml移液枪吸取配制好的分离胶加入玻璃胶板中，然后缓慢加入双蒸水进行封闭去除分离胶中的气泡。
d.约30min后分离胶凝固。待分离胶凝固后，使用上海生工sds-page变性丙烯酰胺凝胶快速制备试剂盒配制6ml浓缩胶。取50ml烧杯，分别加入2ml双蒸水、1ml质量分数为30％的acr-bis(acrylamide与bisacrylamide的质量比为29：1)、3mlgelbuffera、0.06ml质量分数为10％的aps、0.006mltemed混匀。将玻璃胶板上层双蒸水倒掉，用滤纸沿一侧将残留水分吸干，加入配置好的浓缩胶，并迅速插上梳子。
e.待浓缩胶凝固后。配制电泳液。使用上海生工的10×蛋白电泳缓冲液。电泳前，用去离子水稀释至1×蛋白电泳缓冲液。将胶板及电泳架放置到电泳槽内，加入适量电泳液，拔掉梳子。
f.样品震荡涡旋上样。marker上样3μl，样品上样10μl，上样完毕后，将两块胶板之间的电泳液加满，随后按照正负极对应盖上盖子进行电泳。
g.首先，在80v条件下，运行30min，待marker条带分离开后将电压调节至110v，运行70min。
(4)转膜
a.使用上海生工的10×转膜液。根据所需转膜缓冲液的体积，按照10×转膜液：去离子水：甲醇体积比为1：7：2的比例预先配制转膜液，置于4℃待用。
b.pvdf膜做好标记(样品名称)，置于甲醇中激活。
c.倒掉电泳液，取出胶板，将凝胶切边，置于转膜缓冲液中，按照夹心法依次将海绵、滤纸、凝胶、pvdf膜、滤纸、海绵按照顺序放置好，小心去除凝胶和pvdf膜上的气泡。然后，按照pvdf膜位于阳极侧，凝胶位于阴极测的规则将夹板插入转膜架中，加入转膜缓冲液，接通电源，电泳槽周围加入冰袋低温300v60min条件运行。
(5)封闭
用镊子将pvdf膜从夹板中取出，放入质量分数为5％的脱脂奶粉封闭液中(转膜侧朝上)，置于摇床上缓慢摇动，室温封闭1h。
(6)一抗孵育
a.封闭完成后，弃去奶粉封闭液，加入适量tbst清洗pvdf膜，置于摇床上快速摇动，清洗3次，每次15min。
b.将hes1、hes5、gapdh抗体按照说明书建议稀释比例稀释，然后将pvdf膜转移至对应抗体溶液中，4℃孵育过夜。
(7)孵育二抗
a.一抗封闭后，加入适量tbst清洗pvdf膜，置于摇床上快速摇动，清洗3次，每次15min。
b.将二抗按照体积比1：8000比例稀释，然后将pvdf膜转移至对应抗体溶液中，室温摇床上孵育2h。
(8)化学发光显影
a.二抗封闭后，将pvdf膜浸润至tbst缓冲液中，置于摇床上洗涤5次，每次15min。
b.取出ecl发光试剂盒，等量混合ecl发光试剂盒中ⅰ液和ⅱ液(皮克级)，用平头镊子钳住pvdf膜，垂直置于吸水纸上吸取膜上tbst缓冲液，然后将膜置于混合液中反应，反应完成后，将pvdf膜吸附蛋白面朝上，置于x光片板上曝光。
扫描条带灰度值，以gadh作为内参，对各组的目的蛋白表达量进行分析。结果表明，在药物作用24h后，hes1、hes5蛋白均未出现明显的表达下调，在药物作用48h后，hes1、hes5蛋白表达量相较于对照组显著下调。与细胞在药物孵育24h后无明显凋亡，48h后明显凋亡相互印证。这说明非达霉素通过notch通路，从而抑制肿瘤细胞增殖。
实施例3非达霉素对4t1-荷瘤小鼠的体内抑制肿瘤作用
通过建立4t1-荷瘤小鼠模型来考察非达霉素的体内抗肿瘤与notch通路抑制作用，其方法与结果如下：
材料与分组：6-8周(体重20-22g)的雌性balb/c小鼠30只，实验分组为非达霉素高剂量组(f-1,50mg/kg)、非达霉素中剂量组(f-2,25mg/kg)、非达霉素低剂量组(f-3,5mg/kg)、阳性对照dapt组(25mg/kg)、化药5-fu(25mg/kg)组、生理盐水组。
4t1-荷瘤小鼠模型构建：收集培养细胞悬浮于pbs中制备成1×107/ml细胞悬液，在小鼠腋下位置接种乳腺癌细胞4t1，每只0.2ml。
给药：待肿瘤生长到体积大概100mm3时开始给药，每两天给药一次，共给药三周。每天测量肿瘤体积和小鼠体重。
肿瘤解剖：给药结束第二天使用二氧化碳窒息法处死小鼠，然后使用手术器械将给药组和模型组的小鼠解剖，完整剥离出肿瘤瘤组织。结果表明非达霉素中、高剂量组肿瘤体积与生理盐水组相比有显著差异(p
实施例4非达霉素体内抑制notch信号通路
westernblot检测肿瘤组织中hes1、hes5的蛋白表达：
首先进行肿瘤组织中全蛋白提取，称取100mg肿瘤组织，手术剪剪碎肿瘤组织，尽量去除脂肪组织及结缔组织等非目的组织，用预冷pbs洗涤两次，离心取沉淀后加入1ml的预冷lysisbuffer，使用电动组织匀浆器将肿瘤组织匀浆，置于冰上裂解10min，15000g，4℃条件下离心10min，取上清转移至新的预冷的离心管中，即为全蛋白提取物
然后根据实施例2中操作步骤分别进行电泳、转膜、封闭、一抗孵育、二抗孵育、化学发光显影与条带灰度值扫描。以gadh作为内参，对各组的目的蛋白表达量进行分析。结果表明，非达霉素高、中、低剂量组均显著下调notch通路下游蛋白hes1、hes5的表达。
